1 引言
己烷雌酚（hexestrol，HEX）、己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）和双烯雌酚（dienestrol，DE）是结构相近的人工合成雌激素，均含有酚羟基，为弱酸性化合物，主要用于提高奶牛产奶量。由于其致癌作用[1]，欧盟已禁止使用，美国和加拿大则限量使用。目前国内使用较多的为己烯雌酚，国家规定动物组织中不得检出己烯雌酚，但对己烷雌酚和双烯雌酚残留的测定标准尚待制定，因为双烯雌酚已证实为己烯雌酚的代谢产物[2]。因此，快速准确检测牛奶中雌激素对于估计食品安全的潜在因素是很必须的。目前文献报道免疫分析[3, 4]、GC/MS[5～7]、HPLC/MS[8]和SPEHPLC[9]为测定药物、环境和生物体中己烯雌酚残留的测定方法。然而，由于化学结构相似和质荷比相近，低浓度残留等因素为色谱分离３种雌激素带来了很大困难[10]。只有毛细管电色谱[10]和GC/MS[11]成功分离和确证了雌激素。但是，两方法均需要复杂的样品处理，GC/MS还需要衍生化，不适于日常大量样品的检测。对于HPLC和其它微柱分离牛奶中３种雌激素的方法未见报道。
本研究采用简单快速的基质固相分散技术，比较３种填料对酚类雌激素残留进行提取和净化的效果，并研究不同 流动相和色谱柱对３种雌激素的分离。结果为PSA填料对样品具有较好的选择性和富集效果；Xterra C18对３种雌激素能达到记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。>基线分离；Hypersil C18也能分离３种雌激素。出峰顺序与Xterra C18不一致，可通过双柱对阳性样品进行确认。
2 实验部分
2.1 仪器及试剂
Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪，配置四元泵溶剂淋洗系统，自动进样系统，2487双波长紫外/可见检测器；旋转蒸发仪（Heidolph Laborota 4000）；匀浆机（飞利浦公司）；低速离心机（TDL40B, 上海安亭公司）； 固相萃取装置（SUPELCO）及Sartorius纯水器(Germany)。
己烯雌酚(diethylstilbestrol, Dr. Ehrenstorfer GmbH, 99.0%)、己烷雌酚（hexestrol, Dr. Ehrenstorfer GmbH, 98.5%）、双烯雌酚（dienestrol, Dr. Ehrenstorfer GmbH, 99.5%），甲醇和乙腈（Fisher, HPLC级）；二氯甲烷 、甲醇（分析纯）；C18填料（Phenomenex）；N丙基乙二胺(PSA)填料（Varian）；Florisil填料（SUPELCO）。
2.2 色谱条件
色谱柱Xterra C18(250 mm×4.6 mm，5μm，Waters，USA)，流动相为20 mmol/L磷酸/ 乙腈（42/58, V/V）或者Hypersil C18 (250 nm×4.6 mm, 5μm, Thermo, USA), 流动相为20 mmol/L H3PO4/ 乙腈（60/40, V/V），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样20μL，波长为230 nm。
2.3 样品处理
准确称取1 g均质样品于研钵中，用稀氨水调整pH值至8.5，加1 g PSA填料，在通风橱中放置30 min, 挥干水分，充分研磨，均匀装入底部垫上滤纸的10 mL注射器，上层再垫一片滤纸，并把填料轻轻压紧。先用二氯甲烷配制的3% 甲醇溶液5 mL冲洗柱子，不收集，用5 mL二氯甲烷配制的20% 甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于5 mL具塞刻度离心管中，氮气吹至近干；流动相溶解定容至0.25 mL, 经0.45 μm滤膜过滤，待测。
3 结果与讨论
3.1 基质固相分散
MSPD的原理是将样品和键合固定相载体混合研磨，使样品组织细胞碎裂，待测组分通过扩散进入键合的有机相，然后选择合适洗脱强度的溶剂把待测组分洗脱出来。常用键合固定相有C18和Florisil[12～14]。
研究了3种填料C18、Florisil和PSA对牛奶的净化效果。由于C18为反相填料，洗脱剂使用极性溶剂作为洗脱剂，优化条件使用70%甲醇水溶液为洗脱剂，净化效果差，蛋白等共萃物多。
Florisil对3种雌激素吸附能力弱，使用3%二氯甲烷/甲醇能把3种雌激素完全洗脱，脱蛋白净化效果中等，共萃物多，选择性差。
图１ 不同甲醇/二氯甲烷比例的洗脱曲线 （略）
Fig．１ Elution curve of different methanol/dichloromethane concentration ratio
PSA为极性吸附作用力，并具有阴离子交换的多种作用力的固相萃取填料，对弱酸性的雌激素有离子作用吸附力。实验对比３种填料研究结果表明，PSA对样品净化效果最好。其洗脱曲线如图1。从图1可知，洗脱剂比例中甲醇/二氯甲烷＜3%，不能解吸附雌激素，只有当洗脱剂中甲醇/二氯甲烷比例＞10%，才能大量洗脱雌激素。因此，3% 的甲醇/二氯甲烷作为预洗脱溶剂， 20%的甲醇/二氯甲烷作为洗脱剂，可以达到样品净化和富集效果。
3.2 HPLC色谱分离条件的优化选择
对Bondapak NH2（300 mm×4.6 mm, 5 μm, Waters, USA），流动相为H2O/乙腈，其它条件与2.2节一致。改变流动相比例均不能分离３种雌激素。
对Novapak C8（300 mm×4.6 mm, 5 μm, Waters, USA），流动相为20 mmol/L H3PO4/ 乙腈 ，其它条件不变，经优化实验，H3PO4/乙腈比例为75∶25，3种雌激素只能分离DES和DE（其中DE和HEX重合为一个峰）。尝试几种缓冲盐作为分离体系，均不能成功分离3种雌激素。
对Xterra C18，流动相为20 mmol/L H3PO4/乙腈，其它条件不变，经优化实验，H3PO4/ 乙腈比例为42∶58能分离3种雌激素，DE与DES分离度为1.02，HEX与DES分离度为3.06，可准确定性，定量(如图2a)。
对Hypersil C18流动相为20 mmol/L H3PO4/乙腈，其它条件不变，经优化使用，H3PO4/ 乙腈比例为60∶40,能分离3种雌激素。DES与HEX分离度为0.98，HEX与DE分离度为0.75，出峰顺序为DES、DE、HEX（如图2b）。由于两品牌色谱柱出峰顺序不一致，对于检出雌激素残留的阳性样品可通过双柱进行确认，可消除杂质的干扰，保证结果的可靠性。
结果表明，硅胶上连接的烷基链长，非极性作用力强，对3种结构相近的合成雌激素分离度好。由于不同厂家生产的C18柱中硅胶纯度不一同，导致出峰顺序不一致。
图2 Xterra柱(a)和Hypersil柱(b)分离3种雌激素（0.1 mg/L）的色谱图（略）
Fig.2 Chromatograms of three estrogens separated by Xterra (a) and Hypersil (b)
3.3 定量标准曲线、检出限及日内稳定性实验
配置浓度为0.02、0.05、0.1、0.2和1.0 mg/L的HEX、DE、DEX标准混合溶液，取20 μL进样，测定记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。>基线构成之面积称峰面积>峰面积。以记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。>基线构成之面积称峰面积>峰面积对浓度作曲线，计算出回归方程。分别测定３种雌激素的记录器上出现的一个个曲线称为色谱峰。>色谱峰面积的精密度和日内稳定性，7次测定记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。>基线构成之面积称峰面积>峰面积的相对偏差小于2.6%。每1 h进样1次，8 h内记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。>基线构成之面积称峰面积>峰面积的相对偏差小于3.5%，说明3种雌激素在常温下较稳定，不易分解（避光条件下）。3种雌激素在0.02～1.0 mg/L范围内线性关系良好，其检出限LOD（根据信噪比S/N=3）和方法的定量下限结果见表1。
表1 回归方程，相关系数及检出限（略）
Table 1 Regression equation, correlation coefficient and detection limit
3.4 精密度，回收率
准确称取样品11份，其中5份加入5 μg标准溶液100 μL ，另5份添加2 μg标准溶液100 μL，剩余1为样品空白。以测定值除以标准加入量计算回收率，并计算该方法的相对标准偏差，结果见表2。 <br />
表2 方法的准确度和精密度（n=5）（略）
Table 2 Ｔest of recovery and relative standard deviation （n=5）
3.5 样品分析结果
对云南省进行无公害认证的5个品牌牛奶的样品进行抽样检查，分别按照上述方法进行处理和分析，测定结果令人满意，所有样品均低于本方法检出限,未检测出雌激素残留。
