摘要 采用盐酸水解、邻苯二甲醛－氯甲酸芴甲酯（OPA－FMOC）柱前衍生反相高效液相色谱法测定了经碱性蛋白酶脱蛋白处理后的天然胶乳中可溶性蛋白质的氨基酸含量。从16种氨基酸的变化考察了所选酶对乳胶中可溶性蛋白质的水解性能，以氨基酸总量变化评价脱蛋白的效果。结果表明，所选用的碱性蛋白酶对胶乳中的可溶性蛋白的肽键都能水解，在水解过程中蛋白质的氨基酸的组成是变化的。该法对胶乳中可溶性蛋白质的检出限达1.5mg/L（进样5μL，S/N=2），结果不受蛋白质中氨基酸组成变化的影响。对牛血清白蛋白的氨基酸组成分析结果表明，该法准确度高。
关键词 高效液相色谱法，可溶性蛋白质，氨基酸，天然胶乳
HPLC Detemination of Amino Acids in Latex Hydrolyzates
Deproteinized with Alkaline Proteinase
Deng Yifeng, Ye Ying, Huang Maofang
( South China Tropical agricultural Product Processing and Research Institute, Zanjiang 524001)
Abstract A method using precolumn derivatization with o - phthalaldehyde(OPA) and fluorenylmethyl chloroformate(FMOC chloride) is reported for the determination of amino acids in protein hydrolyzates extracted from the latex deproteinized with the alkaline proteinase. Monitoring the change of mole fractions of 16 amino acids was used to check the hydrolysis performance of the alkaline proteinase employed. The degree of deproteinization was evaluated by determining the residual amount of total amino acids. The results indicated that the proteolytic enzyme employed was capable to hydrolyze all the peptide bonds of proteins in the natural latex. The composition of amino acids in the extractable proteins is changing throughout the hydrolysis process. The detection limit of extractable proteins in natural latex is 1.5 mg/L (5 μL injected, S/N=2 ). Changes in protein composition do not affect the analytical results. Analysis of a bovine serum albumin(BSA) reference material indicated that this method was sensitive and accurate.
Keywords HPLC, Amino acid, Extractable protein, Natural latex
天然胶乳制品中的可溶性蛋白质被公认为天然胶乳制品对人的致敏源，脱除及检测胶乳制品中可溶性蛋白质的方法已引起广泛关注，通常采用凯氏定氮法和劳里(Lowry)比色法[1,2]测定。凯氏定氮法是将样品中含氮化物中的氮转化为氨进行测定；劳里法是基于酚试剂与蛋白质中芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸）的显色反应和双缩脲试剂与肽键的显色反应的复合测定法。这两种方法得到的是特定组成蛋白质的当量，不适合蛋白质中氨基酸组成变化时蛋白质的测定[3]。本文采用酸水解、邻苯二甲醛－氯甲酸芴甲酯（OPA－FMOC）柱前衍生反相高效液相色谱法测定胶乳制品中可溶性蛋白质的氨基酸含量，由氨基酸的总量得到蛋白质的含量，方法准确，结果不受蛋白质中氨基酸组成变化的影响。该法已成功地应用在酶法脱蛋白胶乳研究中，为酶的选取和胶乳脱蛋白效果的评价提供了可靠手段。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
HP1100型高效液相色谱仪，配在线脱气机，四元梯度泵，自动进样器；HP1046型荧光检测器。
牛血清白蛋白(Mr=66000),Sigma试剂；氨基酸标准溶液，250μmol/L，惠普公司提供；OPA和FMOC氨基酸衍生试剂和硼酸缓冲液(pH=10.2，0.2mol/L)，惠普公司提供；分析纯试剂:醋酸钠、三乙胺、苯酚；色谱纯试剂:四氢呋喃、乙腈、甲醇；优级纯盐酸;二重蒸馏水。
1.2 色谱条件
色谱柱：HypersilC18柱(125mm×4mmid,5μm)。流动相A:20mmol/LNaAc－0.018％( )三乙胺－0.3％( )四氢呋喃,pH=7.2；流动相B:100mmol/LNaAc(pH=7.2)－乙腈－甲醇(体积比20∶40∶40)。柱温40℃，进样1μL，流速1mL/mim。流动相梯度：0.0～17.0minB相从0％到60％，17.0～18.0minB相从60％到100％，37min后转回100％A相。荧光检测器程序:0.0～14.0min激发波长为340nm，发射波长为450nm；14.0～18.0min激发波长为260nm，发射波长390nm，37min后复始。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备把用碱性蛋白酶以一定工艺条件进行脱蛋白处理后的加氨离心浓缩天然橡胶胶乳和未经处理的对照胶乳分别制成胶乳手套。在手套上剪取相应的胶乳膜片作为脱蛋白胶乳膜片和对照胶乳膜片。
1.3.2 可溶性蛋白质的提取取2片7cm×7cm的上述胶乳膜片（约2g）作为样品试片，在室温下置于直径10cm盛有20mL0.01mol/L磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）的培养皿中沥滤3h，每隔30min翻转试片一次。取沥滤液在3000r/min的离心机中离心30min，取上清液进行水解。
1.3.3 牛血清白蛋白（BSA）溶液称取3.65mgBSA溶于水中，定容至10.0mL，得质量浓度为0.365g/L的BSA溶液。
1.3.4 酸水解将离心得到的胶乳沥滤液上清液和BSA溶液分别置于安瓿瓶中与浓盐酸以体积比1∶1混合。在上述安瓿瓶中加入少许苯酚，吹入氮气数分钟后立即封口。将封口后的安瓿瓶置于110℃的恒温干燥箱中水解22h。
1.3.5 测定将水解后的试液过0.45μm滤膜，取一定体积的滤液在70℃水浴中以氮气吹干，视样品含量加入一定体积的硼酸缓冲液(0.2mol/L,pH=10.2)溶解后备测。
采用自动进样器进行OPA－FMOC衍生，外标法定量。
2 结果与讨论
2．1 牛血清白蛋白的氨基酸组成测定
对牛血清白蛋白(BSA,Mr=66000)的氨基酸组成作了测定，结果列于表1。结果与文献值吻合[4,5]。
表1 BSA的氨基酸组成分析结果(n=4)
Table 1 Analytical results of amino acid composition in BSA（n=4）
|
Amono acid |
Number of amino acid in a BSA molecule |
|
Literature value |
Result |
|
Asp(天门冬氨酸) |
54 |
54.6 |
|
Thr(苏氨酸) |
34 |
32.8 |
|
Ser(丝氨酸) |
28 |
28.2 |
|
Glu(谷氨酸) |
79 |
78.9 |
|
Pro(脯氨酸) |
28 |
29.8 |
|
Gly(甘氨酸) |
16 |
19.1 |
|
Ala(丙氨酸) |
46 |
46 |
|
Val(缬氨酸) |
36 |
34.6 |
|
Met(蛋氨酸) |
4 |
4.6 |
|
lle(异亮氨酸) |
14 |
45.6 |
|
Leu(亮氨酸) |
61 |
59.9 |
|
Tyr(酪氨酸) |
19 |
20.7 |
|
Phe(苯丙氨酸) |
27 |
28.7 |
|
Lys(赖氨酸) |
59 |
53.8 |
|
His(组氨酸) |
17 |
17.7 |
|
Arg(精氨酸) |
23 |
23.3 |
*以丙氨酸的文献值为参比（Ala of literature value used as refe-
rence）
2．2 方法的应用
采用优选的分析条件对经酶法脱蛋白处理过的胶乳膜片和未经处理的胶乳膜片中的可溶性蛋白质进行对照分析，从16种氨基酸摩尔分数的变化,考察所选碱性蛋白酶水解乳胶中可溶性蛋白质的性能，用氨基酸总量来评价可溶性蛋白质的残余量以寻找脱蛋白的最佳工艺条件。实验结果如表2。结果表明,所选酶对胶乳中可溶性蛋白质的肽键都能水解，但不是等摩尔比进行的，蛋白质的氨基酸组成在水解过程中是变动的，该法测定蛋白质具有不受蛋白质的氨基酸组成变化影响的优点。图1为脱蛋白胶乳中可溶性蛋白质的氨基酸色谱图。
表2 胶乳试片对照试验结果(n=4)
Table 2 Control experiment results of latex test piece(n=4)
|
Amino acid |
Deprotein test piece |
Control tset piece |
|
content |
Mole fraction |
Content |
Mole fraction |
|
b/(μmol . g-1) |
x/% |
b/(μmol . g-1) |
x/% |
|
Asp(天门冬氨酸) |
0.487 |
7.2 |
1.687 |
8.5 |
|
Glu(谷氨酸) |
1.420 |
20.9 |
2.371 |
11.9 |
|
Ser(丝氨酸) |
0.368 |
5.4 |
1.308 |
6.6 |
|
His(组氨酸) |
— |
— |
0.152 |
0.76 |
|
Gly(甘氨酸) |
0.602 |
8.9 |
1.875 |
9.4 |
|
Thr(苏氨酸) |
0.213 |
3.1 |
0.780 |
3.9 |
|
Ala(丙氨酸) |
1.190 |
17.5 |
2.556 |
12.9 |
|
Arg(精氨酸) |
0.164 |
2.4 |
0.418 |
2.1 |
|
Tyr(酪氨酸) |
0.209 |
3.1 |
1.076 |
5.4 |
|
Val(缬氨酸) |
0.396 |
5.8 |
1.522 |
7.7 |
|
Met(蛋氨酸) |
0.086 |
1.3 |
0.145 |
0.73 |
|
Phe(苯丙氨酸) |
0.187 |
2.8 |
1.020 |
5.1 |
|
lle(异亮氨酸) |
0.176 |
2.6 |
0.942 |
4.7 |
|
Leu(亮氨酸) |
0.328 |
4.8 |
1.385 |
7.0 |
|
Lys(赖氨酸) |
0.494 |
7.3 |
1.439 |
7.2 |
|
Pro(脯氨酸) |
0.474 |
7.0 |
1.208 |
6.1 |
|
Total(总和) |
6.794 |
|
19.88 |
|
2．3 方法的检出限
OPA－FMOC柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸的检出限平均为9μg/L（进样5μL,S/N=2）。以该法测定的16种氨基酸总和扣除水解反应增加的水来作为蛋白质含量,可测得0.15mg/L蛋白质。由于乳胶中可溶性蛋白质的16种氨基酸比例悬殊（最大约20倍），对胶乳中可溶性蛋白质的检出限实际为1.5mg/L，比劳里(Lowry)法的检出限3mg/LBSA当量[6]略优。
胶乳的可溶性蛋白中还可能有色氨酸和胱氨酸（半胱氨酸），在本文中作了省略。
作者简介：邓亦峰， 男， 39岁， 高级工程师
作者单位：华南热带农产品加工设计研究所 湛江 524001
参 考 文 献
1 ISO 1656－1996, Rubber, raw natural, and rubber Latex, natural— determination of nitrogen content.
2 ISO/CD 12243－3，天然橡胶胶乳－胶乳制品中可溶性蛋白质的测定.陈方平译.胶乳工业，1996(2－3): 32
3 管原洁，副岛正美. 蛋白质的定量法. 张 旭译. 北京： 农业出版社，1981.12～13
4 牟德海. OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸含量. 色谱, 1993, 15(4): 320
5 Godel H, Seitz P, Verhoef M. OPA－FMOC 联用全自动柱前衍生氨基酸分析——Amino Quant氨基酸分析法. 周 原译. 惠普应用通讯, 1995(1): 1
6 Yusof F, Yeang H Y. 胶乳手套蛋白质总含量测定的新方法.吴爱文译.胶乳工业，1993(3): 3
