高效液相色谱有四方面重要的作用。
① 分离分析药物的组分含量：由于一种药剂常含有多组分，色谱方法是既能分离又能定量的方法。如脂溶性维生素片，含有铬维生素，有C18柱及含1%碳酸铵的甲醇为流动相。一次即可将各维生素B6、D1、A、E同时分离并定出含量。又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。
② 药物生产中进行中间控制：生产抗菌素时，首先要了解发酵液中的主体与付产物的存在情况。例如：青霉素、四环素、头孢子菌素、红霉素、柔红霉素、庆大霉素等的发酵产物，均可用C18柱和甲醇及缓冲液配制的流动相或用离子对法，分析主体及其收产物的含量。对普鲁卡因酰胺、茶碱等可进行主体含量的测定，对硝酸甘油可测定主体含量及其降解产物，以便保证药物的热量。
③ 分析药物在体内的残量：这是近来研究新药效能很主要的内容之一，如冬凌草甲素是植物中的一组分，有抗癌效果，但是毒性大。测定其在血清中含量很重要，现在可用C18柱及甲醇水为流动相，测定处理后的血清样品，即可得到血中的含量。如磺胺类药品在血清及尿中含量也不允许太大，可用C18柱及酸性乙醇为流动相，测定含量后，则可估计最合适的用药剂量。又如四环素、巴比妥酸、止痛药、退烧药、护糖尿病的药物等，在血或尿中的含量都可用C18柱用甲醇、水为流动相来测定含量。因此，反相色谱法应用范围极广。
④ 测定药物在各种器官中的代谢产物，特别是研究药物的代谢产物在血清中存在的情况。如测血清中的酮酸及戊二酸。测尿中代谢产物更为方便，不需要繁锁的预处理。因为研究尿中的组分能鉴别病人的代谢功能，对病理研究或监床诊断均具有重要的参考价值。