摘要:目的：建立大环内酯类药物吉他霉素的高效毛细管电泳分离方法。方法：以微乳毛细管电泳分离模式对吉他霉素各组分的分离进行了研究；考察了电泳体系各因素对分离的影响。结果：以0.08 mol.L-1正庚烷-10%异丙醇-0.01 mol.L-1硼酸钠-0.12 mol.L-1SDS(pH 9.0)作为微乳液，在柱温30　℃，电压25 kV，检测波长214 nm条件下分离吉他霉素，各组分得到了良好分离；重现性考察结果表明，6次测量主组分A5迁移时间的RSD为0.7％，峰面积RSD为1.9％。结论：微乳毛细管电泳在吉他霉素组分分离方面的成功应用，为结构相似的中性物质的分离提供了一种新方法,也为日后的定量测定提供了依据。
关键词　吉他霉素　组分　微乳毛细管电泳
　　吉他霉素（kitasamycin）是十六元环大环内酯类抗生素，疗效优于红霉素。目前国内外生产的产品主要含A族（A1，A3～A9）组分［1］，由于国内外不同厂家所用的菌种不同，故产品的组分比例也有差异，从而影响产品的优劣和临床疗效。文献［2～4］均采用HPLC法测定组分，但分离效果较差，各组分间不能达到基线分离，误差较大。
　　微乳毛细管电泳（MEEKC）法为毛细管电泳的一种新分离模式，所采用的运行缓冲液又称微乳液，由有机相、水相、表面活性剂和共表面活性剂组成，此法已用于一些药物的分离［5，6］，迄今国内外报道仅十几篇，用于吉他霉素的分离分析作者未见文献报道。本实验采用这种新的分离模式首次对吉他霉素组分进行了分离，通过实验条件的优化，得到了较为满意的结果。
1　仪器与试药
　　P/ACE 5500型高效毛细管电泳仪（美国Beckman公司），DAD检测器，GOLD软件工作站，智能酸度计，毛细管柱：57 cm×75 μm(有效长度：50 cm，河北永年光导纤维厂)。
　　吉他霉素样品（本省3家生产单位提供）。
　　正庚烷、正丁醇、异丙醇、硼酸钠、磷酸及SDS均为分析纯，甲醇为色谱纯，水为二次重蒸馏水。
2　方法
　　毛细管每次开机前依次用0.1 mol.L-1氢氧化钠溶液和水分别冲洗5 min，最后用运行缓冲液冲洗平衡10 min，2次测定间用运行缓冲液冲洗3 min ,以压力方式于阴极处进样10 s，检测波长214 nm。
2.1　溶液的配制
2.1.1　样品溶液　取吉他霉素适量，加50％甲醇溶液超声溶解，制成约0.5 mg.mL-1的溶液。
2.1.2　磷酸盐缓冲液（ 80 mmol.L-1,pH 6.0）　称取磷酸氢二钠2.86 g,加水至100 mL ,用6 mol.L-1 磷酸调pH 至6.0 。
2.1.3　运行缓冲液（ 0.08 mol.L-1正庚烷-10%异丙醇-0.01 mol.L-1硼酸钠-0.12 mol.L-1SDS） 称取硼砂0.38 g,SDS 3.27 g,加水50 mL超声溶解 ,加入正庚烷1.2 mL、异丙醇10 mL,混匀后,加水至100 mL,调pH至9.0,用0.2　μm滤膜过滤。
3　结果与讨论
3.1　分离模式的选择　实验曾采用30 mmol.L-1胆酸钠-20%乙腈-80 mmol.L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.0），65%乙腈-35 mmol.L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.0）系统作为运行缓冲液，前者只分离出4个组分，且胆酸盐放置1　d后即析出，后者只出1个单峰，说明普通的CE及MEKC分离模式不能有效地分离结构极为相似的吉他霉素各组分，而采用MEEKC模式，则得到了较好分离。
3.2　微乳液pH对分离的影响　pH能改变溶质的表观电荷数，从而影响各组分在水相和微乳液油滴内相的分配。吉他霉素为弱碱性多组分化合物，各组分pKa非常接近。根据文献［7］选择运行缓冲液pH的原则，即选用pH=pKa-log　2,本实验选择pH 7.5,8.0,8.5,9.0,9.4各条件考察电迁移行为的变化及对分离的影响。实验表明，pH对各组分分离度影响较小，但随着pH增大，迁移时间略为延长，同时基线趋于平稳，以pH为9.0时，基线最平稳，故选pH 9.0作为最佳pH。
3.3　SDS浓度的影响　SDS量影响组分的容量因子，从而影响电迁移。本实验考察了柱温为30 ℃,pH为9.0条件下，SDS浓度从70 mmol.L-1到120 mmol.L-1对分离的影响。实验表明，SDS浓度较低时分离较差，区带相互重叠，当SDS浓度增至120 mmol.L-1时，各组分才达到基线分离。
3.4　硼酸钠浓度的影响　实验比较了30 ℃柱温，pH 9.0,SDS浓度为120 mmol.L-1条件下，硼酸钠浓度在0.005～0.02 mol.L-1范围内对分离的影响。结果表明，随着硼酸钠浓度的增加，分离效果有所改善，但分析时间也随之延长。兼顾分离和迁移时间2因素，选择0.01mol.L-1的硼酸钠浓度为最佳浓度。
3.5微乳液中异丙醇加入量的影响　文献［5，6］报道的微乳液采用正丁醇作共表面活性剂，但笔者应用于吉他霉素组分的分离，效果不够理想，虽经各种因素优化，仍未达到基线分离，而改为异丙醇，分离度则得到大大改善，实验考察了7.3%，10%,12.5%,15%等不同异丙醇加入量对分离的影响，以A5和A6 2组分的迁移时间对异丙醇加入量作图，见图1。结果表明，组分的分离度随异丙醇加入量增大而增大，但迁移时间却大大延长，兼顾分离度和分析时间，选10.0%异丙醇为最佳条件。
3.6　电压对分离的影响　电压在15～27 kV范围内变化时,组分迁移时间随着电压升高而减小,柱效也随之加大,当电压大于25 kV时,分离柱效开始下降,这是由于产生了焦耳热。虽然15 kV时，各组分间分离度最大，但分离时间也最长，故实验选择最优电压为25 kV。
3.7　柱温对分离的影响　柱温在20～35 ℃范围内变化时，随着温度升高，迁移时间缩短，但分离度下降，峰数目减少，系峰合并所致，优选温度为30 ℃。
3.8　各组分的分离及峰归属的确定　在上述优选的条件下，典型图谱见图2。A8，A7，A6，A5，A4，A3的迁移时间分别为24.19，25.75，29.00，30.06，32.51，33.26 min。吉他霉素系多组分抗生素，各组分纯品不易得到，本文参照HPLC图谱的流出峰次序及各组分的极性大小［4］来确定各峰归属，即极性大的组分先出峰，这与MEEKC的分离机理相一致，见图2。(略)
3.9　重现性　在优选的条件下，重复进样6次，以A5组分为例，迁移时间的RSD为0.7%，峰面积的RSD为1.9%。
3.10　微乳液的稳定性　文献［6］指出，当共表面活性剂分子结构中C数目与有机相分子结构中的C数目之和等于表面活性剂分子结构中C数目时，该微乳液相当稳定，在室温下能放置数月。而本实验所采用的微乳液在放置2 d后，有分层现象，说明溶液不够稳定，其稳定性以及异丙醇在微乳液中所起的作用有待进一步研究。
3.11　不同厂家A5主组分相对百分含量比较　目前国内外生产的吉他霉素组分主要为A5组分，故本文以测定A5组分的相对百分含量来比较不同厂家的产品。实验采用上述优选的MEEKC方法和文献［2］HPLC方法进行测定，按面积百分比法计算，结果见表1。 从表1可知，MEEKC法所测A5组分的相对百分含量均比HPLC法测得值低，这是由于前法能将A5组分有效分离。不同厂家生产的样品A5组分含量不同，提示各主组分间的比例可能有所差异。
表1　吉他霉素A5组分的相对百分含量（%，n=3）
4　小结
　　微乳毛细管电泳在吉他霉素组分分析中的成功应用，为结构相似的亲脂性化合物组分的分离提供了一种有效的方法，只要解决了吉他霉素纯组分制备问题，就有可能对各组分进行定量分析，从而评价国内、外各厂家产品的优劣，此项工作正在进行中。
洪利娅（浙江省药品检验所　杭州　310004）
郦玲（浙江省天台药品检验所）
参考文献
1．朱汝锦.柱晶白霉素的生物合成、化学和生产.医药工业，1988，19(10):469
2．中华人民共和国卫生部部标准（试行）.WS-177（X-121）91
3．日本抗生物质医药品基准解说.1990.618
4．王永金，王立群，闵翠娟等.柱晶白霉素的高效液相色谱分析.沈阳药学院学报，1990，7（2）：79
5．周国华，罗国安，古单良等.乙酰螺旋霉素活性成分的分析.分析化学，1998,26(2):137
6．Maria F Miola ,Martin J Snowden ,Kevin D Altria . The use of microemulsion electrokinetic chromatography in pharmaceutical analysis . J Pharm Biomed Anal,1998,18(4):785
7．Terabe S, Yashima T. Separation of oxygen isotopic benzoic acids by capillary zone electrophoresis based on isotope effects on the dissociation of the carboxyl group. Anal Chem,1988,60(17):1673