等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

　　⒈IEF的基本原理 在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。

　　⒉pH梯度的组成 pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度，如图16-3所示。

　　⒊两性电解质载体与支持介质 理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小，易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开，而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。

　　常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。

　　电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在5％的三氯醋酸中去除两性电解质，然后再以适当的方法染色。