摘要:植物蓖麻种子的抽提液经sepharose 4 B 柱和sephadexG2100柱分离纯化,得到一种毒蛋白,利用光谱图和反相高效液相色谱来确认毒蛋白的纯度。根据标准相对分子质量曲线,得到它的相对分子质量并与SDS-PAGF (十一烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)所得结果进行比较,用氨基酸自动分析仪测定了其氨基酸组成。

    氨基酸从蓖麻(Ricinus communis)种子中分离出来的毒蛋白具有很强的抑制蛋白质合成的功能和很强的细胞毒性,目前国内外学者竞相研究,被广泛用于抗癌免疫毒素[ 1～3 ]及生物农药的研究[ 4 ] 。我们根据蓖麻毒蛋白对半乳糖的特殊亲和能力,用琼脂糖凝胶进行分离,用高效凝胶蛋白分离柱,结合光电二极管阵列检测器和反相高效液相色谱对分离峰进行纯度检验,并对制得的蓖麻毒蛋白进行了分子量和氨基酸的测定。

    1　实验部分

    1. 1　仪器与试剂

    LC-4A高效液相色谱仪, SPD2MA光电二极管阵列检测器(以上均为日本岛津产品) ; CSF-A超声波清洗器(上海超声仪器厂) ; 高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司产品) ;日立835型氨基酸组成分析仪(日本) 。

    磷酸二氢钠,磷酸氢二钠,氯化钠,硫酸铵(均为AR) ;牛血清蛋白,卵清蛋白,溶菌酶,天花粉蛋白(均为上海生化所产品) ;蓖麻种子(购于山西定襄农业技术推广中心)

    1. 2　实验方法

    1. 2. 1　蓖麻毒蛋白粗提液的制备

    称取50. 0 g去壳蓖麻籽,在5mmol/L磷酸缓冲液(PBS, pH 6. 5,含100mmol/L NaCl,缓冲液A)中匀浆。匀浆液放置3～4 h。用四层纱布滤去残渣,过滤后的溶液于15 000 r /min离心15min。小心除去沉淀和溶液表面的白色脂肪,取上清。在上清液中加入固体(NH4 ) 2 SO4 达到60%饱和度, 放置2 ～3 h, 20 000r /min离心20min。倒去上清,把沉淀溶解在缓冲液A中,并用蒸馏水透析8 h ×3, 20 000 r /min离心20min,上清液即为蓖麻毒蛋白粗品(以上均在4℃下进行)

    1. 2. 2　蓖麻毒蛋白粗提液的分离纯化

    sepharose 4 B 柱( 2 cm ×24 cm ) 用缓冲液A(pH 6. 5)平衡后,将粗提液过柱,先用同一缓冲液A洗脱除去杂蛋白,再用含100mmol/L D-半乳糖的磷酸缓冲液B洗脱,流速均为1ml/min,在λ = 280 nm处,得两个峰(图1) ,峰1 为杂蛋白峰,收集峰2 的流出液。sephadex G2100凝胶过滤柱(2 cm ×40 cm)用缓冲液A (pH 6. 5)平衡后,上图1中峰2的馏分,用缓冲液A洗脱,在λ = 280 nm处,得单一峰(图2) 。收集图2中峰的流出液,经浓缩、透析、冷冻、干燥得到毒蛋白的冻干粉R。

    1. 2. 3　蓖麻毒蛋白的纯度鉴定

    蛋白R在SDS2PAGE电泳带和IEF聚焦电泳带上均表明是纯品。以缓冲液A (pH 6. 5)作流动相,蛋白R在两根串联蛋白柱( Protein2pak 125)上分离,得单一纯峰(图3) 。用光电二极管阵列检测器对图3峰中特定时间进行紫外光谱扫描,并画出紫外光谱图(图4) ,蛋白R在= 280 nm处有最大吸收,显示明显的蛋白特征光谱。

    2　结果与分析

    2. 1　蓖麻毒蛋白相对分子质量的测定

    以牛血清蛋白(67 000) 、卵清蛋白(43 000) 、天花粉蛋白(27 000) 、溶菌酶(14 000)为标准蛋白,用与图3相同的分离条件得到相对分子质量与洗脱体积的校正曲线。在相同条件下测出R的保留体积后,根据相对分子质量校正曲线算出R毒蛋白相对分子质量为66 500。同时按Laemmli[ 5 ]的方法在SDS2PAGF进行电泳,测出R 的相对分子质量为66 000,两者基本一致。

    2. 2　等电点的测定

    按文献[ 6 ]的方法,蓖麻毒蛋白在圆盘电泳槽中进行IEF。蓖麻毒蛋白浓度为0. 2mg/ml,每管的上样量为50μl, 3～5个重复,以不点样为对照。把有蛋白的胶条进行考马斯亮蓝R2250染色8 h,脱色至出现蛋白带,记下蛋白带在胶条中相应的位置。无蛋白的胶条切成0. 5 cm长的小段,加入含0. 5ml双蒸水的试管中,室温摇48 h,然后用pH计测出每管的pH, 绘出标准曲线。根据蛋白带在胶条中相应的位置,从标准曲线上查出R的等电点为pH 6. 8。

    2. 3　氨基酸组成的测定

    蛋白经6N HCl110℃水解24 h后,在日立835型氨基酸自动分析仪上进行分析,测得蛋白的氨基酸组成如表1,结果以摩尔分数( y)表示。

    3　讨论

    (1)为了得到纯的蛋白,粗提液必须重复过柱,多次洗脱收集,充分透析去掉杂蛋白。

    (2)鉴定毒蛋白纯度时,用2根串联的Protein-pak125高效蛋白柱,分辨率高,分离效果好,鉴定结果可靠。

    (3)表1中氨基酸组成只是一部分,因蛋白酸解后,色氨酸( Trp )和半胱氨酸(Cys)被破坏不能测定,另外在酸解过程中, 谷氨酰胺( Gln) 和天门冬酰胺(Asn)分别转化为谷氨酸( Glu)和天门冬氨酸(Asp )进行合并计算。

参考文献

1　董巨莹,王剑波. 蓖麻毒素修饰物诱导小鼠肝脏肿瘤坏死因子[ J ]. 第四军医大学学报, 1997, 18, (1) : 78.

2　李霖,朱德生. 蓖麻毒素修饰物脂质体的研制及其抗肿瘤作用[ J ]. 癌症, 1997, 16, (6) : 414～416.

3　乔生军,莫忠根,林琳. 蓖麻毒素A链蛋白的表达、活性及其对人肺腺癌细胞SPC的毒性作用[ J ]. 中国癌症杂
志, 2000,10, (1) : 27～30.

4　赵建兴,张树怀,佘国珍等. 蓖麻毒素粗提物杀虫作用的研究[ J ]. 内蒙古农业大学学报, 2001, 22, (4) : 78～80.

5　CatsimpoolasN, LeuthnerW, et al. Charactenization of soybean p roteins by immunoelectrophoresis[ J ]. ArchBiochem Biophs,1968, 127, (1 - 3) : 338.

6　郭尧君. 蛋白质电泳实验技术. 北京: 科技出版社[M ].1999, 161～213.