摘要

    目的：建立重组人白介素-11的高效凝胶色谱含量测定方法。

    方法：采用外标法，色谱柱：Biosep SEC-S2000 (300mm×7.8 mm)，流动相：0.2mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，流速：0.5 mL/min，检测渡长：280nm。

    结果：线性范围：2.5～30μg(r=0.9990)，平均回收率101.1％～101.9％(RSD <1.8％，n=9) 精密度：RSD= 0.75％( n=5)；最低检测限0.15μg。结论：该法用于测定重组人白介素-11的含量，简便，准确，重现性好。

    关键词：重组人白介素-11；高效凝胶色谱法

    白细胞介素-11(1nterleukln-11)是90年代初 研究发现的一类多功能造血调控因子，临床上用于陶化疗引起的血小板减少症 。重组人白介索-1l是利用基因工程技术在大肠杆菌中表达生产的重组蛋白类药物．它具有自细胞介素-11的生物功能其蛋白含量是基因工程产品的重要质控指标之一常用的蛋白含量测定方法有紫外法、Lowry法、氨基酸分析及定氮法 等．紫外法需高纯度样品以获得消光系数，且大分子聚合物的存在会产生光色散作用．使结果偏高；Lowry法操作繁琐．且保护剂或赋形剂常对测定有干扰．样品需前处理；氨基酸分析及定氮法分别测定总氨基酸和总氮量，因样品中含有甘氡酸作为稳定剂．也不能直接测定、利用高效液相色谱法可直接测定蛋白含量，同时也能对有关杂质及赋形剂组分进行分离，方法简便快捷。本文采用体积排阻高效液相色谱法，测定重组人白介素-l1含量．得到满意结果 ，

    1 仪器及材料

    Beckman液相色谱仪：126 Solvent Module输液泵、168二极管阵列检测器、Cold色谱处理系统；Millio超纯水装置；对照品：重组人白介素-1l冻干粉(NEUMEGA．Geneties Institute公司)；样品：重组人白介素-l1半成品及其粉针分别由国内不同厂家提供；空白样品溶液(pH7.0磷酸盐缓冲液含2.3％甘氨酸)由厂家提供；所用水为Nillie超纯水，其余试剂均为分析纯

    2 色谱条件

    色谱柱：Phenomenex Biosep SEC-S2000(300mmx 7.8mm)；流动相：0.2mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.8)；流速：0.5mL/min； 柱温： 室温(25℃)；检测波长280nm；进样20μL。

    3 实验条件选择

    3．1 色谱柱试用了Pharaaeia Bioteh Superose 12H／30及Biosep SEC-S2000 2种型号的分子筛柱：以对二聚体的分离为主要考察指标，结果SEC一S2000柱能够分离二聚体，而Superose 12H柱在所选择系统中．经改变pH及离子强度，虽能获得较好柱效，但不能分离二聚体。故选择SEC-S2000作为分析柱。

    3．2 流动相分别对流动相的组成、离子强度、pH及流速等因素进行了考察。试用了磷酸盐、碳酸氢氨及古SDS的溶液系统，结果用0.2mol/L 磷酸盐(pH 6.8)溶液分离效果较好；降低离子强度(小于0.1 mol/L 时)，保留时间不变，但柱效降低；低流速对分离有利．但保留时间相应延长，试验了0.4～1.0 Ml/min 不同流速，以0.5 mL/min 较好。

    3．3 检测波长经二级管阵列检测，重组人白介素-11分别在280nm及214nm处有最大吸收，同一样品在214nm和280 nm处检测．其峰面积的RSD分别为l.8％和0.75％ (n=5)．故本实验选择280nm作为检测波长。

    3．4 系统适应性试验取重组人白介素-l1冻干粉适量于60℃烘箱中加热5d．取出．用水溶解．制成1mg/mL。。溶液．取20μL注入液相色谱仪。 在所选色谱条件下分离度(以重组入白介素-11单体和二聚体之间的峰谷高与二寨体峰高之比来计算)为0.2；理论塔板数以重组人自介素-11峰计算为9000。

    4 测定方法与结果

    4．1 线性关系取重组人白介素-l1对照品适量，精密加水溶解，制成5mg/mL 溶液作为对照品储备液，-20℃冰箱保存，备用：精密吸取对照品储备液适量，分别用水制成0.125，0.25，0.375，0.5，0.75，1.0，1.5 mg/ml的溶液作为对照品溶液，取各对照品溶液20μL．分别注入液相色谱仪，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线 在0.125～l.5mg/mL(2.5～30μg)时．浓度与峰面积呈良好线性关系：Y=95479X-47545 r=0.9990。

    4．2 精密度试验取对照品溶液(0.5mg/mL )20μL，注入液相色谱仪，重复进样5次，记录峰面积，RSD为0.75％(n=5)：

    4．3 回收率试验精密吸取对照品储备液适量，用水制成2mg/ml溶液，再分别精密吸取80，100．120μL各3份，加空白样品液至200μL，混匀，按含量测定项下方法测定，3种浓度回收率平均值分别为101.9％，101.5％，101 .1％，RSD <1.8％ (n=9)

    4．4 最低检出限取对照品溶液稀释成0.0625mg/mL，取不同量进样，当信噪比为3：1时，测得最低检出量为0.15 μg。

    4．5 样品测定取重组人白介素-11粉针3瓶，每瓶用水制成1mg/mL 溶液．作为制剂供试液；另取半成品溶液适量，用水制成1mg/mL 的溶液，作为半成品供试液；另取对照品储备液适量，加水制成1mg/mL 的溶液，作为对照品溶液。取对照品溶液和供试液各20μL，分别注入液相色谱仪．记录峰面积，按外标法以峰面积计算，3个厂家9批半成品的结果，3个厂家9批制剂的结果。

    5 讨论

    5．1 3个厂家的半成品及制剂各9个批号的含量测定结果显示，不同厂家的产品质量存在差异，厂家Ⅱ的3批半成品含量按标示量计算均低于55％一在细胞实验中也未能检出活性，提示蛋白含量与生物活性有一定相关性。由于该厂家同批制剂的蛋白含量与生物活性均符合规定，所以半成品的失活可能与储藏条件有关：高浓度有利于蛋白的稳定。

    5．2 凝胶色谱是根据分子筛的原理对不同分子大小的蛋白进行分离，故本法还能同时检查高分子蛋白和水解片断。采用本法对制剂进行了分析，结果在光照条件下，杂质除二聚体外，有部分降解片段：高湿下降解片段比例增高；而加热条件下杂质主要为二聚体

    5．3 本文建立的高效凝胶色谱法可用于重组人白介素-11的含量测定，同时可作为纯度检查的手段之一。本实验结果可为产品质控方法的建立提供参考。

    参考文献

    l 李佩，白介素-l1研究新进展，国外医学及血液学分册．199518(4)：22l