关键词：石杉碱甲；色谱法，高效液相；含量测定

　　石杉碱甲（huperzine A）是由徐择邻等于1985年从蕨类植物——石杉科(Huperziaceae)马尾杉属(Phlegmariurus)的华南马尾杉［P.fordii(Baker) Cheing］中首次分离得到^［1］。它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂^［2］，对重症肌无力、记忆力减退和老年性痴呆具有较好的效果^［3］。石杉碱甲的片剂已通过卫生部审批上市。石杉科植物有5个属26个种，我国除了华南马尾杉外，还有蛇足石杉［Huperzia serrata（Thunb）］、长柄石杉［H.longipetiontata(Spring)］、中间石杉［H.serrata f.intermedia (Nakai)］、长白山石杉［H.luciduca var.asiatica Ching］、四川石杉［H.sutchueniana (Herter)］、湖北石杉［H.hupehensis Ching］、闽浙马尾杉［P.mingcheensis Ching］、广东马尾杉［P.guangdongensis Ching］、马尾杉［P.phlegmaria (Linn.) Hulod］、狭叶马尾杉［P.mingcheensis var.angustifolius C.Y.Ma］、龙岩马尾杉［P.longyanensis C.Y.Ma］、矮小马尾杉［P.nanus C.Y.Ma］等13种。从我们的研究结果看，我国的上述植物基本都含有石杉碱甲，它们均是石杉碱甲的药物资源。但以蛇足石杉含量和蕴藏量相对较多。
　　由于蕨类植物生长缓慢，繁殖困难，造成了石杉碱甲的原料药价格昂贵，因此，建立一个石杉碱甲含量的快速检测方法很有必要。本文研究了用高效液相色谱法（HPLC）测定蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法。我们首先用石杉碱甲标准品建立分析方法；然后按照常规方法从蛇足石杉中提取出总生物碱，并在HPLC中确定石杉碱甲峰，同时分析总生物碱中石杉碱甲的含量，进而确定被测定植物中石杉碱甲的含量。

1　仪器与试药

1.1　仪器
　　高效液相色谱仪：美国 SP-100泵；SP-200紫外检测器；SP-4600积分仪。
1.2　试剂及样品
　　甲醇为北京化学试剂厂产品，分析纯；标准品石杉碱甲及石杉总生物碱均由本室提供，主要是由蛇足石杉、华南马尾衫和闽浙马尾杉等石杉混合品按照常规方法提取而成。

2　测定条件及方法

2.1　色谱条件
　　色谱柱：C₁₈，5 μm，4.6 mm×250 mm（Microsorb-MV^TM）;流动相：甲醇∶水（85∶15）；流速：1 ml/min　。
2.2　检测波长的确定
　　石杉碱甲紫外静态扫描有三条谱带（图1），分别是λ₁=201.3 nm ,λ₂=231.3 nm,λ_max=312.7 nm。在此HPLC系统中，用λ₁紫外检测基线不稳定；用λ_max则有其他杂峰的干扰，我们选定231.3 nm为检测波长。

图1　石杉碱甲标准品紫外扫描图谱

2.3　计算方法
　　按照下列公式计算：

X=A_i/A_x (C_s^．V_i/W_i)^．100%

　　式中：X——石杉碱甲的含量（%）; A_i——被测样品的峰面积;A_x——被测标准品的峰面积;C_s——标准品浓度（mg /ml）;V_i——被测样品定溶体积（ml）; W_i——被测样品质量（mg ）。
2.4　标准品的配制
　　精密称取石杉碱甲标准品20.50 mg,溶解于0.02 mol/L的盐酸水溶液中并定容于100 ml（为备用液）。

3　方法学考察

3.1　线性关系的考察
　　以外标法定量。分别取备用液2.0，4.0，6.0，10.0，15.0，20.0及30.0 ml置于50 ml容量瓶中，并用流动相稀释至刻度。分别进样同体积测定积分面积，记录并储存色谱图。以石杉碱甲的峰面积Y为纵坐标，对进样量X为横坐标进行回归，得到线性回归方程：Y =920699X+1448，r=0.999 8。其线性范围在0.410～6.150 mg/L之间。数据见表1。

表1　石杉碱甲校正曲线的数据

3.2　精密度实验
　　按照上述方法、步骤进行操作，测得该方法的日内精密度及日间精密度（表2、3）。

表2　石杉碱甲日内精密度结果

表3　石杉碱甲日间精密度结果

3.3　加样回收率实验
　　结果见表4。

表4　石杉碱甲加样回收率结果

4.1　石杉碱甲峰的确定
　　在石杉总生物碱中，有50多个生物碱成分。确定总碱在此HPLC系统中的石杉碱甲，则是含量测定的基础。我们经过正向柱（SiO₂）、反相柱(C₁₈)与不同的检测波长、不同的流动相、石杉碱甲峰的动态和静态扫描比较等，确定了石杉总生物碱中的石杉碱甲峰（图2）。在反相柱条件下，石杉碱甲峰的保留时间是t_R=6.95 min ,紫外动态扫描吸收波长λ₂=231.3 nm ,与石杉碱甲标准品的静态扫描的紫外吸收波长λ₂=231.3 nm 完全一致，从而确定了此系统中的石杉碱甲峰。

图2　石杉总生物碱HPLC图谱

4.2　保留时间
　　在该HPLC系统中，石杉总生物碱中的石杉碱甲峰的保留时间是t_R=（6.96±0.12 ）min，n=20。
4.3　待分析样品的处理
　　分别取批号9501,9502,9503,9504和9505的石杉总生物碱50 mg，放入60℃烘箱中恒重24 h。然后分别称取石杉总生物碱9501批20.00 mg，9502批12.2 mg，9503批7.50 mg，9504批10.70 mg和9505批17.21 mg，分别置于10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，备用。
4.4　样品的测定
　　按照标准曲线的方法进行含量测定。结果见表5。样品放置一周后再次测定含量没有变化，说明石杉碱甲在此体系中较为稳定。

表5　总碱中石杉碱甲的含量

　　我们建立了用HPLC反相柱从石杉总碱中直接测定石杉碱甲的方法，该方法线性与精密度良好，平均回收率为99.89%,平均RSD为 0.40% 。用此方法测定了5批石杉总碱样品，重复性好。该数据的可靠性，在生产石杉碱甲的工作中得到了证实。
　　从石杉碱甲原植物中提取总生物碱，是一个常规和稳定的方法。通过测定总碱中石杉碱甲的含量，便可以推算出原植物中石杉碱甲的含量。该方法已经成为检定原植物的方法并应用于工作中。

［作者简介］杨明(1958-)，男，河北秦皇岛人，实验师，硕士。
杨明(军事医学科学院毒物药物研究所，北京　100850)
姚志伟(军事医学科学院毒物药物研究所，北京　100850)
赵毅民(军事医学科学院毒物药物研究所，北京　100850)
栾新慧(军事医学科学院毒物药物研究所，北京　100850)

参考文献

［1］徐择邻,储宾孟,栾新慧.福定碱的结构测定［J］.解放军医学杂志 1985；10：263.
［2］王月娥.石杉碱甲的抗胆碱酯酶的作用［J］.中国药理学报 1986；7（17）：110.
［3］程源深,吕传真,应智林.石杉碱甲治疗重症肌无力症候28例［J］.新药与临床 1986；5(4)：197.